Предпочтение гена при заболевании мочи кленового сиропа

1. Таблица 1
2. Таблица 2
3. Таблица 3
4. Таблица 4
5. Таблица 5

Болезнь мочи кленового сиропа (MSUD; MSUD типа Ia [MIM 248600 ], МСУД тип II [МИМ 248610 ], MSUD тип Ib [MIM 248611 ]) является редкой врожденной ошибкой метаболизма, затрагивающей <1 на 180 000 новорожденных в общей популяции (Peinemann and Danner 1994 ; Чжуан и Ши 1995 ; Даннер и Доеринг 1998 ). Несмотря на редкость, MSUD встречается во всех расовых и этнических группах по всему миру (Даннер и Эльзас 1989 ). Неврологические осложнения и смерть в период новорожденности могут быть результатом этой неспособности катаболизировать аминокислоты с разветвленной цепью (BCAA), лейцин, изолейцин и валин. Патофизиология нелеченного MSUD не совсем понятна. Программы скрининга новорожденных в большинстве штатов и в некоторых зарубежных странах выявляют лиц, подверженных риску заболевания. Пострадавшие люди страдают от непереносимости белков и должны питаться синтетическими диетами, которые ограничивают потребление этих важнейших BCAA (Elsas и Acosta 1988 ). Эти модифицированные белком диеты обеспечивают почти нормальный рост и развитие для затронутых индивидуумов, но должны быть адаптированы к индивидууму, демонстрируя один аспект сложности этого единственного генного признака (Scriver and Waters 1999 ; Дипл и МакКейб 2000 ).

Неспособность катаболизировать BCAA является следствием нарушения функции комплекса α-кетокислотной дегидрогеназы (BCKD) с разветвленной цепью. BCKD окислительно декарбоксилирует α-кетокислоты с разветвленной цепью (BCKA), образующиеся при переаминировании BCAA. Этот митохондриальный мультиферментный комплекс полностью кодируется ядерными генами. Четыре белковых продукта придают каталитическую функцию, а два других белковых продукта используются для регуляции состояния активности BCKD в разных тканях (Gillim et al. 1983 ; Wagenmakers et al. 1984 ). Эта регуляция необходима для предотвращения истощения BCAA, поскольку BCKD присутствует во всех клетках. Необходимость такого широкого распространения BCKD в тканях не понята.

Из четырех генов, которые передают каталитическую функцию, три кодируют белки со специфичностью для субстратов BCKA. Четвертый каталитический генный продукт также функционирует с другими митохондриальными комплексами (Yeaman 1989 ). Хотя наследование MSUD придерживается простого аутосомно-рецессивного паттерна, мутации в каждом из этих трех BCKD-специфических генов, как было показано, вызывают MSUD. Два из этих генов кодируют субъединицы (E1α [ Z14093 ] и E1β [ M55575 ]), которые образуют гетеротетрамер, который использует тиамин-пирофосфат в качестве кофактора для декарбоксилирования BCKA (ssonvarsson et al. 2000 ). Третий продукт гена, ацилтрансфераза (E2 [ X66785 ]) коровый белок, переносит ацильный фрагмент с разветвленной цепью в кофермент А (Yeaman 1989 ; Рид и Хаккерт 1990 ).

Большинство описанных к настоящему времени мутаций происходило в гене, который кодирует субъединицу E1α (Danner and Doering. 1998 ). Остается показать, имеет ли какой-либо из этих трех генов повышенную тенденцию к мутации. Несмотря на то, что все гены были охарактеризованы и их хромосомное местоположение идентифицировано, нет простого способа определить, содержит ли ген E1α, E1β или E2 мутантные аллели. Единственный мутантный аллель, обнаруженный с какой-либо частотой, существует в сообществе меннонитов и связан с эффектом основателя (Danner and Doering 1998 ).

Поиск простого, надежного метода для идентификации конкретного мутантного гена, который вызывает MSUD из трех возможных вариантов, представляет собой проблему. Вестерн-блоты могут быть использованы для определения лиц с MSUD, у которых отсутствует белок E2 (Danner et al. 1985 ). Однако снижение антигенного присутствия E1α, E1β или обоих может быть результатом мутаций в любом гене, поскольку это влияет на способность образовывать тетрамер α2β2. В некоторых клеточных линиях MSUD белки комплекса антигенно неотличимы от белков, наблюдаемых в клетках с нормальной активностью. Таким образом, иммуноблоты имеют ограниченную ценность, помогая идентифицировать ген, несущий мутантные аллели.

Измерения ферментативной активности в культивируемых клетках, полученных от пациентов, используются для подтверждения клинического диагноза MSUD, сделанного путем количественной оценки концентрации BCAA в плазме. Мы и другие показали, что нарушенная активность BCKD функционально восстанавливается в культивируемых клетках путем эпизодического добавления кДНК дикого типа для дефектного гена (Litwer et al. 1989 ; Koyata et al. 1993 ; Mueller et al. 1995 ). Здесь мы используем этот подход BCKD-активность-комплементация для идентификации гена, несущего мутантные аллели. Ретровирусные плазмиды, содержащие последовательность кДНК дикого типа, были сконструированы для каждого из трех MSUD-специфических генов для эффективной и действенной трансдукции как фибробластов, так и лимфобластов. Клеточные линии с определенными мутациями от индивидуумов с MSUD использовали для установления условий для анализа BCKD после трансдукции. Как показано на рисунке, возвращение функции к BCKD ясно видно через 72 ч после трансдукции лимфобластов и может специфически отличать дефектный ген, несмотря на то, что предполагаемая эффективность трансдукции составляет всего 30%. Продукция субъединицы, кодируемой вирусным вектором, была продемонстрирована с помощью вестерн-блоттинга митохондриального белка из E2-негативной клеточной линии, трансдуцированной векторами E2 и E1β (). Эффективность трансдукции в культурах фибробластов составляет> 70% к 48 часам; таким образом, анализы активности BCKD могут быть выполнены в это время ().

Вестерн-блот белков BCKD в митохондриях. Митохондрии были получены из клеток ЕМ6229 без вирусной трансдукции или после трансдукции с помощью вектора E2 или E1β, и 20 мкг были разрешены для иммуноблотов. Митохондрии из клеток DG75 служат в качестве контрольной линии дикого типа.

Таблица 1

Активность BCKD в линиях лимфобластов с определенными генотипами от пациентов с MSUD

Среднее ± SD Общая активность BCKD a (пмоль 14CO2 / мг белка / 3 ч) мутация гена мутанта клеточной линии, не трансдуцированная E1α E1β E2 EM408 E1α Y438Nb 0 ± 0 166 ± 51 0 ± 0 0 ± 0 EM1952c E1β N176Y / R324X 24 ± 2 10 ± 1 364 ± 89 19 ± 6 EM3069d E2 1031G → A / (20-kb del) 71 ± 3 71 ± 14 82 ± 21 149 ± 43 DG75 Нет 6,158 ± 626 ND ND ND

Таблица 2

Активность BCKD в линиях фибробластов с неизвестными генетическими мутациями у пациентов с MSUD

Среднее ± SD Общая активность BCKD a (пмоль 14CO2 / мг белка / 3 ч) CellLine Нетрансдуцированный E1α E1β E2 EM15496 11 ± 4 2,437 ± 13 8 ± 0 10 ± 2 EM5621 1 ± 9 5 ± 0 2,128 ± 58 17 ± 1 EM4566 22 ± 3 29 ± 12 26 ± 4 2112 ± 453 EM1118b 3 281 ± 113 ND ND ND

Этот анализ фермент-комплементации был применен к 63 клеточным линиям от индивидуумов с MSUD и без известного предка меннонита. Это представляет собой крупнейшую единичную выборку, использованную для анализа генотипа MSUD. Никакой другой квалификации не было наложено на выборку. Клеточные линии были получены от врачей по всему миру и включали людей из Северной, Центральной и Южной Америки; Европа; и азия. Этот образец включает 34 мужчины и 29 женщин, в соответствии с аутосомно-рецессивным характером MSUD. Как показано на рисунке, мутации в гене для E1β на хромосоме 6 приблизительно равны частоте мутаций E1α, тогда как мутации в E2 встречаются несколько реже. Напротив, 52% ранее охарактеризованных мутантных аллелей были результатом дефектов в гене для субъединицы E1α на хромосоме 19, и 36% были дефектами в E2, как обобщено в (Chuang and Shih 1995 ; Даннер и Доеринг 1998 ).

Процент клеточных линий с мутациями в каждом из трех генов, вызывающих MSUD. А , Результаты 63 клеточных линий с использованием восстановления активности BCKD. Двадцать девять женщин и 34 мужчины, за исключением лиц с известным наследием меннонитов, были протестированы. B , Сводка процентов на основе мутаций, описанных в другом месте.

Результаты пяти лимфобластоидных линий и одной линии фибробластов были неоднозначными, когда использовался этот комплементационный анализ BCKD. Для четырех клеточных линий стимуляция остаточной активности не наблюдалась ни с одной субъединицей в трех отдельных трансдукциях для каждой клеточной линии. Две другие клеточные линии показали <10% увеличение остаточной активности с двумя различными субъединицами. Пять из шести клеточных линий имеют остаточную активность> 2% от активности BCKD дикого типа, условие, которое использовалось для определения «прерывистой» или «промежуточной» формы MSUD (Peinemann and Danner 1994 ). Напротив, большинство других 57 клеточных линий имеют остаточную активность, которая составляет <2% от активности BCKD дикого типа (). Вестерн-блоты митохондриальных белков из пяти из шести клеточных линий, которые дали неоднозначные результаты, показывают антигенное присутствие во всех субъединицах. У одного отсутствовало антигенное присутствие как E1α, так и E1β. Другая клеточная линия, которая была обнаружена неоднозначной в анализе лимфобластов, была разрешена, когда фибробласты от пациента были проанализированы; это, вероятно, было результатом более высокой эффективности трансдукции для фибробластов. К сожалению, фибробласты доступны не для всех исследованных пациентов. Определение специфических мутаций в клетках с неоднозначными данными комплементации решит эти вопросы и даст более четкое понимание изменчивости MSUD, особенно в отношении «промежуточного» фенотипа (Пейнманн и Даннер 1994 ).

Таблица 3

Распределение клеточных линий MSUD на основе мутантного гена и процентной остаточной активности BCKD выше, чем в контрольных линиях

Число клеточных линий MSUD, у которых остаточная активность по сравнению с таковой в BCKD дикого типа представляет собой мутантный ген <2% 2% -10%> 10% E1α 19 1 1 E1β 23 0 1 E2 9 3 0 Ambiguousa 1 3 2

Несколько меньшая частота мутаций, связанных с геном E2 в хромосоме 1, может быть реальной, но возможны и другие объяснения. Во-первых, если в клеточных линиях, которые дают неоднозначные результаты, есть мутации в гене E2, то получится равное распределение мутаций между тремя генами. Второе объяснение может заключаться в том, что мутации E2 отсутствуют на клиническом уровне. Как видно из примера, люди с мутациями E2 могут иметь более высокую остаточную активность, чем та, которая обнаружена в клеточных линиях с мутациями в двух других генах. У некоторых людей не вырабатывается антигенный белок (), и все же происходит некоторое декарбоксилирование кетокислотного субстрата (Danner et al. 1985 ; Ellerine et al. 1993 ). Мутации в E2 также были связаны с «чувствительной к тиамину» формой MSUD (Danner et al. 1975 ; Fernhoff et al. 1985 ; Ellerine et al. 1993 ). Одним из возможных объяснений ответа тиамина является то, что декарбоксилаза Е1, которая использует тиамин-пирофосфат в качестве кофактора в механизме реакции, может функционировать независимо от белка Е2. Промежуточный ацилтиамин-пирофосфатный разветвленный цепной продукт, образующийся в реакции декарбоксилирования, вытесняется избытком тиамин-пирофосфата в клетке, что позволяет ферменту катализировать еще один цикл декарбоксилирования (Herring et al. 1992 ; Даннер и Доеринг 1998 ). Независимая функция E1 может объяснить более высокую остаточную активность, наблюдаемую для мутантных клеточных линий E2. В некоторых случаях эта активность может быть достаточно высокой, чтобы предотвратить полный клинический фенотип, и поэтому эти люди никогда не классифицируются как имеющие MSUD.

Способность анализа ферментативной комплементации идентифицировать мутантные гены была подтверждена анализом нуклеотидной последовательности указанного мутантного гена с праймерами, перечисленными в. Результаты для одного пациента из каждой дополняющей группы представлены в. Родительские клеточные линии для каждого пробанда использовали для подтверждения передачи мутантного аллеля. Все три примера оказались гомозиготными по мутантному аллелю, что необычно для MSUD, так как большинство пробандов, охарактеризованных к настоящему времени, являются сложными гетерозиготами. Другим неожиданным результатом было то, что мутантный аллель, определенный для гена E1α в пробанде EM5579, был аллелем, который составляет> 99% MSUD в популяции меннонитов. Ранее считалось, что этот аллель не был обнаружен с большей частотой, чем другие мутации в этом гене в общей популяции. Семья этого пробанда не имеет известного наследия меннонитов, и спаривание не кровное родство. По мере определения большего количества клеточных линий с мутациями в этом гене станет возможным установить истинную частоту этого мутантного аллеля в общей популяции.

Таблица 4

Праймеры, используемые для подготовки ДНК для анализа последовательности нуклеиновых кислот

Ген и праймера (5 '→ 3') Положение в кодирующей последовательности AnnealingTemperature (° C) E1α: Вперед CTAAACCGTGGTTTGAGCCA 32-52 54 Обратный GCGTACGCCGCCCCCACCGCC 679-658 вперед GGCGGTGGGGGCGGCGTACGC 685-679 54 Обратный GGTGGGGGTGGGCTGAGCAGG 1374-1353 E1β: Вперед CGGGACTACGGGCAAACTCA 191- 210 58 обратного AGAGCCCCATGACCAACACAGCCCC 628-604 Форвард TGGCTACTCAGGCTCAGG 75-92 50 Обратный TCCCCAGAGCGATAGCGATACTTG 565-542 вперед GGAATCGGAATTGCGGTCACTGGAG 444-468 ​​58 Обратный tcgcgaattcCAGTTACGTTAATGTCAGGGG 1286-1267 Е2: Вперед GCTGCAGTCCGTATGCTGA 18-36 54 Обратный CTAGTAGCATAAAAGCTGGG 1456-1434

Таблица 5

Изменения нуклеиновых кислот в мутантных генах, идентифицированных с помощью комплементационного анализа BCKD

Среднее ± SD Общая активность BCKD a (пмоль 14CO2 / мг белка / 3 ч) Мутант клеточной линии Базовое изменение выделенного нуклеотида b Изменение аминокислоты EM5579 E1α 0 ± 1 136 ± 6 1312T → A Y438N EM608 E1β 37 ± 11 123 ± 18 752T → C V251A EM5591 E2 318 ± 54 569 ± 29 1385G → C R462P

Мутации, описанные в гене E1β, относятся к пробанду, который является продуктом кровного спаривания турецкого происхождения. Мутантный аллель приводит к замене белка V251A. По координатам кристаллической структуры (Ævarsson et al. 2000 ) остатки валина находятся на поверхности тетрамера α2β2, предположительно находящегося в области взаимодействия с коровым белком E2. Пока неизвестно, как эта аланиновая замена в этом положении нарушает функцию BCKD (Ævarsson et al. 2000 ). Второй турецкий пробанд (также продукт кровного родства), который дополнял субъединицу E1β, был гомозиготным по нуклеотидному изменению 1149T → A, вводя стоп-кодон в Y383. Эти результаты свидетельствуют о наличии общего аллеля в семьях турецкого происхождения.

Гомозиготная мутация в гене E2 в пробанде EM5591 вызывает аминокислотную замену R462P. В настоящее время неизвестно, является ли это кровным родством. Остаток R462 является только С-концом предполагаемого сайта связывания кофермента А белка (Danner et al. 1989 ). Кристаллическая структура белка E2 не была решена, поэтому было бы весьма спекулятивно предсказать, каким образом это аминокислотное замещение может изменить способность образовывать сложный эфир СоА.

Сложная природа признаков одного гена объясняется изменением специфических сайтов мутаций, аминокислотных замен в белковом продукте и геномным фоном пораженных особей (Scriver and Waters 1999 ; Дипл и МакКейб 2000 ). Вариация MSUD также может быть результатом того факта, что мутации в трех разных генах могут продуцировать сходный фенотип. Продукты этих генов должны взаимодействовать в мультиферментном комплексе для достижения своей клеточной функции. Чтобы начать разбираться со сложностью MSUD, мы должны сначала спросить, есть ли различия в появлении мутаций в трех генах. Здесь мы использовали этот метод спасения, чтобы идентифицировать дефектную субъединицу и, следовательно, ген с мутантными аллелями. Этот метод был эффективен у 90% протестированных клеточных линий. Ранее необходимо было секвенировать все три гена и исключить полиморфные изменения. Теперь только один ген должен быть изучен на предмет изменений нуклеиновых кислот. Похоже, что мутации происходят в каждом из трех генов, и анализ дополнительных клеточных линий позволит лучше оценить точную частоту. Когда аминокислотные замены возникают в результате этих изменений нуклеиновой кислоты, в будущем может оказаться возможным разработать специфические реагенты, которые будут взаимодействовать с мутантным белком таким образом, что он изменит структуру в функциональную форму. Эти реагенты предложат новую и улучшенную терапию для людей с MSUD.

Похожие